miRNA定量及均一化cDNA文庫技術

發(fā)布時間： 2011/9/23　　點擊次數(shù)： 1294次

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進行一次逆轉錄即可實現(xiàn)所有目標miRNA的測定？沒錯，采用加尾法，一次逆轉錄就可以得到全部miRNA對應的cDNA。

我們知道，真核生物mRNA都是有poly-A尾巴的，這樣Oligo-dT（逆轉錄引物）就很容易結合到mRNA上來合成cDNA了。

miRNA就缺了poly-A尾巴，怎么辦呢？在逆轉錄試劑盒中加入poly-A聚合酶，先給它們加上一串poly-A尾巴，然后用帶有一段通用序列的Oligo-dT和逆轉錄酶來合成cDNA。這樣一來，一次逆轉錄反應就合成了所有miRNA以及其他snRNA、mRNA對應的cDNA，接下來想用來檢測什么都可以！

您只需要提供1μg合格的total RNA，就可以對所有感興趣的miRNA進行檢測。這既可避免莖環(huán)法（各目標miRNA單獨逆轉錄）帶來的逆轉錄效率、加樣誤差等方面的影響，還可節(jié)約多條特異逆轉錄引物和多次逆轉錄反應的花費，可謂一舉兩得，何樂而不為？

均一化cDNA文庫

基因轉錄水平上的巨大差異常常給文庫篩選和分析帶來障礙，采用均一化文庫技術可有效克服這一問題?！【换?cDNA 文庫具有以下4方面的優(yōu)點：*，在經(jīng)濟上具有廣泛的應用空間，可以節(jié)約大量試驗成本。第二，增加克隆低豐度 mRNA 的機會，適用于分析各種發(fā)育階段或各種組織的基因表達及突變檢測。第三，與原始豐度的 mRNA 拷貝數(shù)相對應的 cDNA 探針與均一化的 cDNA 文庫作雜交，可以估計出大多數(shù)基因的表達水平及發(fā)現(xiàn)一些組織特異的基因。而以往的文庫構建，忽略了 mRNA 豐度的影響。第四，可以用于遺傳圖譜的制作和進行大規(guī)模的原位雜交，作為優(yōu)化的文庫系統(tǒng)還可以用于大規(guī)模的測序。

現(xiàn)在，在構建均一化的 cDNA 文庫中至少有2種主要的觀點：一種是基于復性動力學的原理，高豐度的 cDNA 在退火條件下復性的速度快，而低豐度的 cDNA 復性要很長時間，從而可以通過控制復性時間來降低豐度；另一種是基于基因組 DNA 在拷貝數(shù)上具有相對均一化的性質，通過 cDNA 與基因組 DNA 飽和雜交而降低在文庫中高拷貝存在的 cDNA 的豐度。*種方法的掌握對技術的要求比較高，對多數(shù)人而言需要多次摸索才能找到zui適條件；而后一種方法易于掌握，但有研究者根據(jù)復性動力學的原理也提出了其不利因素，即采用基因組 DNA 飽和雜交的方法會因為低拷貝的表達基因拷貝數(shù)少而無法被雜交上。

DSN （duplexspecificenzyme）是zui近發(fā)現(xiàn)的一種熱穩(wěn)定核酸酶（Shagin ., 2002）。該酶能夠選擇性降解雙鏈 DNA 和 DNARNA雜交體中的 DNA，對單鏈核酸分子幾乎沒有作用。同目前常用的均一化技術相比，基于 DSN 的均一化技術操作步驟簡單，所需要的起始材料也比較少，具有較好的應用前景。

上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司開展miRNA定量檢測服務已經(jīng)近三年時間，服務項目幾百個。擁有自己的miRNA引物庫（人類），對其他物種可以自行設計引物，檢測樣品范圍廣，包括：細胞、組織、血液、血漿、血清、細胞培養(yǎng)上清等，操作規(guī)范，時間可控，為廣大研究工作者提供了良好的便利。

同時，其作為國內(nèi)cDNA文庫構建的主流服務供應商，在長期穩(wěn)定的實驗服務過程中積累了豐富的經(jīng)驗，已經(jīng)成功構建包括動物、植物、細菌等幾十個物種的cDNA文庫。他們基于雙鏈特異性核酸酶（Duplex-Specific Nuclease, DSN）的先進cDNA文庫均一化技術，能減低高豐度表達基因100倍以上，有效富集低豐度表達基因，從而降低冗余率。

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