ELISA克隆試劑盒

1 原理：
ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測(cè)定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復(fù)性好。
ELISA 常用的酶和底物
辣根過(guò)氧化物酶，底物為OPD, 深桔 ，檢測(cè)波長(zhǎng)492nm
TMB，藍(lán)綠色，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm
堿性磷酸酶，底物為PNPP（對(duì)－消基苯磷酸酯）,
檢測(cè)波長(zhǎng)405nm
ELISA各步驟的反應(yīng)時(shí)間
包被：24－36h，蛋白濃度為1－5ug/ml
封閉：37ºC 2h 或4ºC過(guò)夜（3％BSA）
樣本反應(yīng)時(shí)間：37ºC 45min-1h
酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間： 37ºC 45min-1h
顯色時(shí)間：15min（避光）
設(shè)對(duì)照
可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆?br />2 類型
（1）間接法測(cè)抗體
間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體，檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。
常用于臨床血清中自身抗體的檢測(cè)，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測(cè)。

（2） 雙抗體夾心法測(cè)抗原
是檢測(cè)抗原zui常用的方法。
只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。
常用的組合：?jiǎn)慰寺】贵w＋多克隆抗體
單克隆抗體＋單克隆抗體
后一組合是兩種單克隆抗體針對(duì)抗原上不同的相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。
用途：測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。例如各種細(xì)胞因子的檢測(cè)。

雙抗體夾心法測(cè)抗原的方法：
捕獲抗體包被→封閉（3％BSA）→待測(cè)抗原→洗滌（含0.1％Tween的PBS）→酶標(biāo)單抗或多抗→洗滌→顯色→檢測(cè)
（3）競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原
1）抗體固相測(cè)抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。
其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，zui后的顯色也愈淺。
方法：抗體包被→封閉→同時(shí)加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原→洗滌→酶底物→顯色→ELISA reader檢測(cè)
2）抗原固相測(cè)抗原
其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。標(biāo)本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，zui后的顯色也愈淺。
方法:
a: 抗原包被96孔板； b:封閉;
c: 待測(cè)抗原與抗體反應(yīng)一定時(shí)間； d: 加入96孔板
e: 洗滌 f：加入酶標(biāo)二抗
g：洗滌 h：顯色和檢測(cè)

（4）IgM抗體的檢測(cè)
1）間接法：
間接法ELISA一般僅適用于檢測(cè)總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定血清中的IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結(jié)合到固相上，將出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 因此，如果用抗IgM作為二抗，間接測(cè)定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。
方法：
a: 抗原包被96孔酶標(biāo)板； b:封閉;
c: 待測(cè)血清與A蛋白反應(yīng)一定時(shí)間后離心
d: 吸取上清液加入96孔酶標(biāo)板
e: 洗滌 f：加入酶標(biāo)抗IgM的抗體
g：洗滌 h：顯色和檢測(cè)
2）捕獲包被法（夾心法）
先用抗人IgM抗體包被ELISA板，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（包括針對(duì)抗原特異性的IgM和非特異性的IgM）。然后加入相應(yīng)抗原，繼而加入針對(duì)抗原特異的酶標(biāo)抗體，再與底物作用，顏色的深淺即與標(biāo)本中的IgM含量成正相關(guān)。
方法：
a: 抗人IgM抗體包被96孔酶標(biāo)板； b:封閉;
c: 加入待測(cè)血清； d: 洗滌96孔酶標(biāo)板
e: 加入相應(yīng)抗原 f：加入抗原特異的酶標(biāo)抗體
g：洗滌 h：顯色和檢測(cè)
（5） ABS-ELISA技術(shù) （Avidin Biotin system-ELISA
原理
親和素是一種分子量是60，000的堿性蛋白，由四個(gè)相同亞基組成，每個(gè)亞基有一個(gè)生物素分子結(jié)合點(diǎn)。兩者均可與抗體等大分子生物活性物質(zhì)相偶聯(lián)，又可被酶類等多種材料所標(biāo)記，成為一種生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。生物素化抗體可捕獲多個(gè)親和素，后者再與酶結(jié)合，加入底物后，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。這一系統(tǒng)可以大大提高ELISA的靈敏度。
操作過(guò)程：
抗原包被→封閉→待檢標(biāo)本→生物素化抗體→洗滌→ 酶標(biāo)記親和素→洗滌→加底物顯色和檢測(cè)